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人外周血TH1/TH2/TH17流式抗體配色方案

更新時(shí)間:2017-11-17 點(diǎn)擊次數(shù):7286

人外周血TH1/TH2/TH17染色

 

注意:采集外周血的抗凝管必須是肝素抗凝管,刺激劑盡量選用凍干粉自己配置;cocktail刺激劑是液體形式,PMA會(huì)因保存不當(dāng)導(dǎo)致活性降低,影響刺激效果,而凍干粉形式的PMA較穩(wěn)定,可以保證刺激效果。

 

人外周血TH1/TH2/TH17染色/流式檢測(cè)方法

 

細(xì)胞刺激步驟:(刺激體系1ml)

取人外周血(肝素抗凝)200 ml加入24孔板內(nèi),加入800 ml的*培養(yǎng)基,再加入1ml PMA(25ug/ml)、1μl Ionomycin(1mg/ml),輕輕吹打混勻細(xì)胞。放入 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激0.5小時(shí)后,每孔再加入2μl Brefeldin A(5mg/ml),輕輕吹打混勻細(xì)胞,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激3.5小時(shí)。

 

流式檢測(cè)步驟

1、收集細(xì)胞于流式管內(nèi),500 g/8min離心,槍頭吸去上清,彈散管底沉淀,加入相應(yīng)的表面染色抗體(CD3\CD8),彈散混勻。室溫避光孵育15分鐘后,500 g/8min離心,槍頭吸去上清;

2、彈散管底沉淀,加入1ml的固定/破膜工作液,(1ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3ml Fixation/Permeabilization  Diluent稀釋),旋渦混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用;

3、室溫避光孵育30分鐘, 600 g/10min離心,在吸水紙上倒扣流式管棄去上清(此時(shí)細(xì)胞已在管底形成很牢固的沉淀,不容易丟 失),彈散管底沉淀;

4、加入1ml Permeabilization Buffer(此為10X,須與蒸餾水1:10稀釋成工作液)工作液離心洗滌細(xì)胞,破膜15分鐘(室溫避光), 600 g/10min,在吸水紙上倒扣流式管棄去上清,彈散管底沉淀;

5、加入100μl Permeabilization Buffer(1x),同時(shí)加入相應(yīng)的細(xì)胞因子染色抗體,室溫避光孵育15分鐘;

6、加1ml Permeabilization Buffer(1x),600 g/ 8min;在吸水紙上倒扣流式管棄去上清;彈散管底沉淀;

7、加入適量體積(建議300~500 ml)的PBS重懸細(xì)胞,并上機(jī)檢測(cè)并分析。

 

注意:1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇相應(yīng)的抗體,并做單染管用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償(具體如何設(shè)置單染管,可參照Biogems流式手冊(cè)補(bǔ)償章節(jié)介紹)。

     2、盡量做同型對(duì)照,因細(xì)胞因子表達(dá)量不高(尤其是IL-4表達(dá)量非常低),細(xì)胞因子抗體對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照一般都要做。

     3、PMA刺激會(huì)導(dǎo)致人T細(xì)胞表面CD4表達(dá)的下調(diào),PMA與Lonomycin聯(lián)合刺激下調(diào)非常明顯,4h刺激后會(huì)下調(diào)50%以上,6h刺激幾乎檢測(cè)不到CD4,因此我們的界定CD4+T細(xì)胞是通過染CD3和CD8,來圈CD3+CD8-的細(xì)胞。

     4、PMA對(duì)小鼠T細(xì)胞CD4表達(dá)影響很小,因此可以直接染CD4來圈門。

     5、因破膜劑對(duì)細(xì)胞損傷較大,建議離心后形成的細(xì)胞沉淀先彈散形成細(xì)胞懸液,在加入破膜劑,這樣會(huì)減少對(duì)細(xì)胞的損傷(形成的細(xì)胞碎片較少)。

 

人外周血TH1/TH17染色結(jié)果

 

             

 

注意:細(xì)胞破膜后對(duì)形態(tài)影響較小,因此可以直接圈淋巴門分析,在通過圈CD3+CD8-的細(xì)胞(此處未列出圖)來分析CD4+的細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的量。因此此圖橫坐標(biāo)就直接標(biāo)的CD4。

 

人TH1/TH2/TH17染色所需抗體及輔助試劑

 

品牌

產(chǎn)品編號(hào)

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

價(jià)格

BioGems

 05111-60

 Anti-Human CD3 PE

25 test/100 tests

700元/

BioGems

 10111-50

 Anti-Human CD8a FITC

25 test/100 tests

560元/

BioGems

 80811-80

 Anti-Human IFN gamma APC

25 test/100 tests

1680元/

BioGems

 81111-77

 Anti-Human IL-4 PE-Cy7

25 test/100 tests

1890元

BioGems

 73821-60

 Anti-Human IL-17A PE

25 test/100 tests

1890元

BioGems

 44212-80-100

 Mouse IgG1 Isotype Control APC

100 mg

1750元

BioGems

 44212-77-100

Mouse IgG1 Isotype Control  PE-Cy7

100 mg 

1890元

BioGems

 44212-60-100

Mouse IgG1 Isotype Control PE

100 mg

1890元

BioGems

2031560-5mg

 Brefeldin A

5 mg

880元

BioGems

5608212-1mg

Ionomycin (calcium salt)

1 mg

880元

BioGems

1652981-1mg

Phorbol 12-myristate 13-acetatePMA

1 mg

880元

BioGems

92110-00-150

Permeabilization Buffer (10X)

150 ml

1030元

BioGems

92160-00-160

Transcription Factor Fixation/Permeabilization Diluent

160 ml

420元

BioGems

92550-00-50

Transcription Factor Fixation/Permeabilizatio Concentrate

50 ml

1050元

 

 

 

總價(jià)

17390元

 

方案提供:Biogems*。Biogems是PeproTech的流式抗體品牌,優(yōu)勢(shì)是基于優(yōu)異品質(zhì)的較低價(jià)位,現(xiàn)正進(jìn)行一系列*活動(dòng)。

 

TH1/TH2/TH17流式抗體檢測(cè)配色方案產(chǎn)品由重慶市華雅干細(xì)胞技術(shù)有限公司授權(quán)代理,:

重慶市華雅干細(xì)胞技術(shù)有限公司  

 

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