人外周血TH1/TH2/TH17染色
注意:采集外周血的抗凝管必須是肝素抗凝管,刺激劑盡量選用凍干粉自己配置;cocktail刺激劑是液體形式,PMA會(huì)因保存不當(dāng)導(dǎo)致活性降低,影響刺激效果,而凍干粉形式的PMA較穩(wěn)定,可以保證刺激效果。
人外周血TH1/TH2/TH17染色/流式檢測(cè)方法
細(xì)胞刺激步驟:(刺激體系1ml)
取人外周血(肝素抗凝)200 ml加入24孔板內(nèi),加入800 ml的*培養(yǎng)基,再加入1ml PMA(25ug/ml)、1μl Ionomycin(1mg/ml),輕輕吹打混勻細(xì)胞。放入 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激0.5小時(shí)后,每孔再加入2μl Brefeldin A(5mg/ml),輕輕吹打混勻細(xì)胞,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激3.5小時(shí)。
流式檢測(cè)步驟:
1、收集細(xì)胞于流式管內(nèi),500 g/8min離心,槍頭吸去上清,彈散管底沉淀,加入相應(yīng)的表面染色抗體(CD3\CD8),彈散混勻。室溫避光孵育15分鐘后,500 g/8min離心,槍頭吸去上清;
2、彈散管底沉淀,加入1ml的固定/破膜工作液,(1ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3ml Fixation/Permeabilization Diluent稀釋),旋渦混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用;
3、室溫避光孵育30分鐘, 600 g/10min離心,在吸水紙上倒扣流式管棄去上清(此時(shí)細(xì)胞已在管底形成很牢固的沉淀,不容易丟 失),彈散管底沉淀;
4、加入1ml Permeabilization Buffer(此為10X,須與蒸餾水1:10稀釋成工作液)工作液離心洗滌細(xì)胞,破膜15分鐘(室溫避光), 600 g/10min,在吸水紙上倒扣流式管棄去上清,彈散管底沉淀;
5、加入100μl Permeabilization Buffer(1x),同時(shí)加入相應(yīng)的細(xì)胞因子染色抗體,室溫避光孵育15分鐘;
6、加1ml Permeabilization Buffer(1x),600 g/ 8min;在吸水紙上倒扣流式管棄去上清;彈散管底沉淀;
7、加入適量體積(建議300~500 ml)的PBS重懸細(xì)胞,并上機(jī)檢測(cè)并分析。
注意:1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇相應(yīng)的抗體,并做單染管用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償(具體如何設(shè)置單染管,可參照Biogems流式手冊(cè)補(bǔ)償章節(jié)介紹)。
2、盡量做同型對(duì)照,因細(xì)胞因子表達(dá)量不高(尤其是IL-4表達(dá)量非常低),細(xì)胞因子抗體對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照一般都要做。
3、PMA刺激會(huì)導(dǎo)致人T細(xì)胞表面CD4表達(dá)的下調(diào),PMA與Lonomycin聯(lián)合刺激下調(diào)非常明顯,4h刺激后會(huì)下調(diào)50%以上,6h刺激幾乎檢測(cè)不到CD4,因此我們的界定CD4+T細(xì)胞是通過染CD3和CD8,來圈CD3+CD8-的細(xì)胞。
4、PMA對(duì)小鼠T細(xì)胞CD4表達(dá)影響很小,因此可以直接染CD4來圈門。
5、因破膜劑對(duì)細(xì)胞損傷較大,建議離心后形成的細(xì)胞沉淀先彈散形成細(xì)胞懸液,在加入破膜劑,這樣會(huì)減少對(duì)細(xì)胞的損傷(形成的細(xì)胞碎片較少)。
人外周血TH1/TH17染色結(jié)果
注意:細(xì)胞破膜后對(duì)形態(tài)影響較小,因此可以直接圈淋巴門分析,在通過圈CD3+CD8-的細(xì)胞(此處未列出圖)來分析CD4+的細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的量。因此此圖橫坐標(biāo)就直接標(biāo)的CD4。
人TH1/TH2/TH17染色所需抗體及輔助試劑
品牌 | 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 價(jià)格 |
BioGems | 05111-60 | Anti-Human CD3 PE | 25 test/100 tests | 700元/ |
BioGems | 10111-50 | Anti-Human CD8a FITC | 25 test/100 tests | 560元/ |
BioGems | 80811-80 | Anti-Human IFN gamma APC | 25 test/100 tests | 1680元/ |
BioGems | 81111-77 | Anti-Human IL-4 PE-Cy7 | 25 test/100 tests | 1890元 |
BioGems | 73821-60 | Anti-Human IL-17A PE | 25 test/100 tests | 1890元 |
BioGems | 44212-80-100 | Mouse IgG1 Isotype Control APC | 100 mg | 1750元 |
BioGems | 44212-77-100 | Mouse IgG1 Isotype Control PE-Cy7 | 100 mg | 1890元 |
BioGems | 44212-60-100 | Mouse IgG1 Isotype Control PE | 100 mg | 1890元 |
BioGems | 2031560-5mg | Brefeldin A | 5 mg | 880元 |
BioGems | 5608212-1mg | Ionomycin (calcium salt) | 1 mg | 880元 |
BioGems | 1652981-1mg | Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA | 1 mg | 880元 |
BioGems | 92110-00-150 | Permeabilization Buffer (10X) | 150 ml | 1030元 |
BioGems | 92160-00-160 | Transcription Factor Fixation/Permeabilization Diluent | 160 ml | 420元 |
BioGems | 92550-00-50 | Transcription Factor Fixation/Permeabilizatio Concentrate | 50 ml | 1050元 |
| | | 總價(jià) | 17390元 |
方案提供:Biogems*。Biogems是PeproTech的流式抗體品牌,優(yōu)勢(shì)是基于優(yōu)異品質(zhì)的較低價(jià)位,現(xiàn)正進(jìn)行一系列*活動(dòng)。
TH1/TH2/TH17流式抗體檢測(cè)配色方案產(chǎn)品由重慶市華雅干細(xì)胞技術(shù)有限公司授權(quán)代理,:
重慶市華雅干細(xì)胞技術(shù)有限公司 , :
重慶市華雅干細(xì)胞技術(shù)有限公司以“專注干細(xì)胞研究,提升干細(xì)胞品質(zhì)”為發(fā)展理念,專業(yè)從事干細(xì)胞基礎(chǔ)研究、干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用研究及干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)。