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從FFPE DNA樣本生成高質(zhì)量NGS文庫的簡化解決方案

更新時間:2020-11-10 點擊次數(shù):1477

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介紹                                                

通常從人體活檢中采集并保存福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)樣本,用于組織學(xué)研究。福爾馬林固定法通過將核酸和蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)容物交聯(lián)并將樣品包裹在蠟中,使材料可在室溫下保存多年。世界各地的生物中心和研究人員儲存了數(shù)以百萬計的FFPE樣本。

隨著文庫準備和下一代測序技術(shù)的進步,這些樣本中保存的核酸現(xiàn)在可以被恢復(fù),以產(chǎn)生重要的基因組信息。因此,存檔的FFPE樣品成為了豐富而珍貴的研究材料來源。越來越多的研究實驗室利用zinq FFPE樣本來分析和了解與疾病相關(guān)的基因和突變多種因素導(dǎo)致了從FFPE分離出的DNA質(zhì)量的變化,包括保存過程中發(fā)生的核酸化學(xué)變化,保存過程缺乏標(biāo)準化,以及存檔樣本的年齡。從FFPE樣本中分離出的DNA質(zhì)量較低,有望產(chǎn)生低復(fù)雜度的NGS文庫,因為盡管分離出的DNA有明顯的濃度,但DNA的“可用”量很低為了創(chuàng)建具有大多樣性的庫,選擇正確的庫準備方法是至關(guān)重要的。ThruPLEX technoloqy使用莖環(huán)適配器,這樣就不需要中間的清理步驟維持單管工作流程,并保持庫的復(fù)雜性。后的擴增利用了所有修復(fù)和連接的分子,結(jié)果在文庫中發(fā)現(xiàn)了大量的*分子(Fiqure 1)。另一個好處是,創(chuàng)建文庫的時間減少到大約兩小時。ThruPLEX DNA-seq庫也可以很容易地與其他應(yīng)用程序集成,如目標(biāo)富集。輸入材料的高度多樣性保證了捕獲將產(chǎn)生文庫的優(yōu)良覆蓋整個基因組的目標(biāo)區(qū)域Figure 1. ThruPLEX technology

 Fiqure 1.采用ThruPLEX技術(shù)。這個工作流程使用了一個三步單管反應(yīng),開始的片段雙鏈DNA,經(jīng)過一個高效的修復(fù)過程。接下來,莖環(huán)適配器被鈍端連接到修復(fù)的輸入DNA上。使用高保真聚合酶對這些分子進行擴展和擴增,使其包括條形碼,從而生成索引化的Illumina NGS庫。

 在本技術(shù)說明中,我們演示了我們的通用文庫準備試劑盒——ThruPLEX DNA-seg試劑盒與ffpe衍生的DNA一起使用時的性能和特點。對于非FFPE樣本,標(biāo)準方案建議的輸入范圍為0.05-50 ng,在此,我們將輸入量增加到100 ng,以補償FFPE樣本中受損的DNA。我們的結(jié)果表明,在Ilumina平臺上從ffpe提取的DNA中制備NGS文庫時,ThruPLEX DNA-seq技術(shù)是一個很好的選擇。與其他庫準備工具包相比,它提供了更多樣化的庫,同時小化了GC偏差。我們進一步演示了ThruPLEX DNA-Seq試劑盒如何與Agilent SureSelect富集試劑盒成功集成,對FFPE樣品進行靶向測序。

 結(jié)果                                                

ThruPLEX DNA-seg技術(shù)生產(chǎn)的文庫比NEB Next Ultra或KAPA Hyper試劑盒更具多樣性。平均而言,ThruPLEX library產(chǎn)生的估算庫大小比NEB Next Ultra大80%,比KAPA Hyper大240%,表明ThruPLEX library中存在更多的*分子(圖2)。正如預(yù)期的那樣,ThruPLEX DNA-seq產(chǎn)生的重復(fù)讀取不到2%。與NEBNext Ultra相似,而KAPA Hyper的重復(fù)reads范圍大(3-6%)(圖2)。對文庫分子插入量的檢查顯示,ThruPLEX DNA-Sea試劑盒產(chǎn)生的插入量為190 bp。大約相當(dāng)于KAPA Hyper庫,但比NEBNext Ultra的150-bp插入長約27%(圖2)。在對配對端讀取時,插入長度越長往往越有利,因為有更多的不重疊讀取,可以更好地表示原始序列信息。

 Figure 2. Highly diverse libraries.

 圖2. 高度多樣化的庫。與其他測試試劑盒相比,ThruPLEX DNA-seq文庫提供了更多*的分子(上圖)和更少的重復(fù)(上圖)。下圖:ThruPLEX DNA-seq創(chuàng)建的分子平均插入尺寸比NEB Next Ultra長-27%。比較了三種試劑盒制備的文庫的GC覆蓋率。ThruPLEX DNA-Seg試劑盒產(chǎn)生了平衡的GC覆蓋率(圖3)。

Figure 3. Uniform GC coverage.

圖3. 均一的GC的覆蓋度。由ffpe衍生的DNA制成的DNA序列分析文庫覆蓋了整個人類基因組。然后使用Agilent ClearSeq Human DNA Kinome面板對ThruPLEX DNA-seg文庫進行富集。在每種情況下,庫的質(zhì)量都很高,如圖4中的數(shù)據(jù)所示。通過測序深度測量的Kinome覆蓋率與樣本有關(guān),并在目標(biāo)面板覆蓋40-50X的情況下進行測序。所有樣品上餌覆蓋率均大于70%

 

圖4. 使用Agilent ClearSeq Human DNA Kinome面板豐富了ThruPLEX DNA-seq文庫的目標(biāo)測序指標(biāo)。

 結(jié)論                                                

FFPE樣本的序列可能非常具有挑戰(zhàn)性。在固定過程中引入的不同程度的化學(xué)損傷減少了可用于構(gòu)建文庫的“優(yōu)質(zhì)”材料的數(shù)量。為此,在這一系列實驗中,我們修改了標(biāo)準的ThruPLEX DNA seq協(xié)議,將輸入量增加到100ng。這使我們能夠創(chuàng)建更多樣化的庫(庫復(fù)雜性高80-240%),并且比其他庫準備試劑盒包含更少的擴增。

訂購信息:

產(chǎn)品編號

產(chǎn)品名稱

單位

R400674

ThruPLEX® DNA-Seq Kit

 24

R400675

ThruPLEX® DNA-Seq Kit

48

R400676

ThruPLEX® DNA-Seq Kit

96

R400677

ThruPLEX® DNA-Seq Kit

480

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