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高起始量帶分子標簽的DNA-Seq分析
更新時間:2020-11-10 點擊次數:1445
高起始量帶分子標簽的DNA-Seq分析 |
ThruPLEX® Tag-Seq HV |
· 更可靠的DNA-Seq分析:文庫中整合了離散且均衡的分子標簽(UMIs),提供更可靠的數據表現! · 兼容更高起始量的多種樣本:5至200 ng FFPE DNA、cfDNA起始,30 μl建庫體積,無需濃縮樣本! · 刪繁就簡:單管三步操作流程,2 h內完成illumina文庫構建! · 一致高效:無畏起始量差異,高實驗重復性、更均一的文庫覆蓋度,高GC含量區域偏差更小! · 更適合于稀有突變分析,減少擴增誤差及測序錯誤! |
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■ 產品說明 |
目前,將NGS用于正確檢測低頻突變的關注度逐漸上升。各領域科研人員正在突破稀有突變檢測靈敏度與特異性的瓶頸,而這些問題主要是由樣品準備、擴增偏差及測序錯誤所引起的。而向illumina文庫添加*的分子標簽(Unique Molecular Identifiers, UMIs)與*的雙端index(Unique Dual Indexes, UDIs),能有效改善稀有突變檢測的準確性。出于文庫制備與測序質量直接相關的考慮,我們特別優化推出了接頭上帶UMIs及整合UDIs的全新產品——ThruPLEX Tag-Seq HV試劑盒。該產品保留了單管流程、操作簡便的特點,支持5至200 ng input DNA起始用于稀有變異分析! |
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正確的樣本數據回溯、更小的手動操作誤差,科研人員再不用擔心珍貴樣本損失了! |
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■ 來自UMIs的“助攻” |
ThruPLEX Tag-Seq HV在莖環形接頭上引入了離散的UMIs,文庫中每個DNA分子有144種可能的標簽組合,漢明間距超過6,具有高度的差異性。我們特別設計了UMI序列,以使序列顏色分布達到平衡,在illumina平臺上能獲得更好的測序數據。我們也謹慎調整了各UMI接頭的濃度,以使144種序列組合在各種DNA起始量都能均勻展現,減少偏差。 |
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由7位堿基所組成的UMIs位于reads的開始位置,能夠”Tag”到DNA模板上,用于識別一致序列,減少擴增或者測序錯誤帶來的假陽性突變。 |
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這種特別優化的UMIs設計,確保了更簡便的樣本demultiplexing過程,分析更容易! |
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■ “抓住”游離DNA,“揪出”稀有突變 |
游離DNA(cfDNA)是由細胞凋亡后所釋放,游離于體液中的DNA小片段。對cfDNA的測序分析具有較大難度,特別是涉及腫瘤學研究中的稀有突變分析時。 Takara科學家采用ThruPLEX Tag-Seq HV對10 ng起始的Quan-Plex Patient-Like ctDNA標準品(AccuRef)構建文庫,該ctDNA(循環腫瘤DNA)標準品帶有一系列特征化的不同頻率(0%,1%,5%)突變位點。文庫構建完成后,腫瘤相關的基因采用IDT xGEN Pan Cancer Panel進行捕獲富集。結果顯示目標區域的捕獲高效可靠,10 ng起始的DNA樣本約有79%的reads來自或者接近目標區域。 |
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上表數據顯示,由坐標法或UMIs去除重復reads后的目標區域平均覆蓋度是相似的,與Picard MarkedDuplicates所報道的PCR duplication結果一致。 隨后,Takara科學家用UMIs鑒定了ctDNA標準品中特定位點的實際突變頻率,結果顯示,檢測到的突變頻率分別與預期1%、5%的等位突變頻率接近,而陰性對照組沒有在位點處檢測到任何突變。 |
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如果采用未去重的文件或僅用坐標法去重的文件,會檢測出大量的超過0.5%等位基因頻率的不一致突變。而UMIs引入、校正后,相應突變體的數量變少了,結果的正確性進一步提升,顯示出UMIs在降低擴增及測序錯誤上的重要作用。 |
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更具代表性的是,使用未去重或者僅用坐標法去重的文件分析,在預期的EGFR L858R突變附近觀察到大量的低頻及隨機等位基因頻率突變。而用UMI校正、過濾后的一致性序列reads,清除了假陽性突變,得到了預期的突變分析結果! |
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訂購信息: 品牌 Code No. 產品名稱 包裝量 Clontech R400742 ThruPLEX® Tag-Seq HV 24 Rxns Clontech R400743 ThruPLEX® Tag-Seq HV 96 Rxns Clontech R400735 ThruPLEX® Tag-Seq HV Core Components 96Rxns Clontech R400734 ThruPLEX® Tag-Seq HV Core Components 24Rxns Clontech R400739 ThruPLEX® HV UDI 1-24 24 Rxns Clontech R400738 ThruPLEX® HV UDI Set A 96 Rxns |
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