各種免疫細(xì)胞的分工與協(xié)作,共同完成免疫應(yīng)答及其調(diào)控,因此,各種免疫細(xì)胞的分離及其功能測定對于了解其在免疫應(yīng)答中的作用及相互關(guān)系有著重要意義。
免疫細(xì)胞分離的方法有很多,主要是根據(jù)細(xì)胞的理化性狀、功能,以及細(xì)胞表面標(biāo)志等的差異而設(shè)計(jì)的。粘附分離法、尼龍毛柱分離法等主要根據(jù)細(xì)胞的屬性(如粘附)和功能不同,旨在將粘附和非粘附或粘附力較小的細(xì)胞分離開。有人證實(shí)免疫細(xì)胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分別為:巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞>樹突狀細(xì)胞=抗體產(chǎn)生細(xì)胞>B淋巴細(xì)胞>T淋巴細(xì)胞=紅細(xì)胞。粘附的細(xì)胞可通過trypsin洗脫而收集。葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法和Percoll不連續(xù)密度梯度離心法等是根據(jù)細(xì)胞的大小及比重的差異進(jìn)行細(xì)胞分離。尚可利用特異性單克隆抗體結(jié)合其它技術(shù)分選細(xì)胞,如補(bǔ)體細(xì)胞毒分離法,洗淘分離法(panning)、流式細(xì)胞術(shù)分離法,以及免疫磁珠法分離細(xì)胞技術(shù)等。一般應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的及所需細(xì)胞的種類、純度及數(shù)量等要求來確定采用何種方法。
Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)
外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral?blood?mononuclear?cell,PBMC)的分離是免疫學(xué)研究中的一項(xiàng)基本技術(shù)。
目前國內(nèi)外分離PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法(ficoll-hypaque?density?gradient?centrifugation),用此方法分離PBMC純度可達(dá)95%,淋巴細(xì)胞約占90%,其中T淋巴細(xì)胞占80%,B淋巴細(xì)胞占4~10%。ficoll-hypaque混合溶液,又稱淋巴細(xì)胞分層液,在分離人PBMC時(shí),要求其比重為1.077;分離小鼠單個(gè)核細(xì)胞時(shí)比重為1.080;分離大鼠單個(gè)核細(xì)胞時(shí)比重為1.084~1.087;分離馬單個(gè)核細(xì)胞時(shí)比重為1.090。
免疫磁珠法分離淋巴細(xì)胞
免疫磁珠法分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合,在外加磁場中,通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場中,無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性,不在磁場中停留,從而使細(xì)胞得以分離。
1.根據(jù)免疫磁珠(immune?magnetic?bead,IMB)的種類,免疫磁珠法分離細(xì)胞可分為直接法和間接法。直接法即將特異性抗體與磁珠相連,IMB可與表達(dá)相應(yīng)膜抗原的細(xì)胞結(jié)合,在磁性分離器(磁架)作用下,連有磁珠的細(xì)胞被吸附在磁架上,從而與其他細(xì)胞分離。間接法即將二抗與磁珠相連,磁珠通過二抗與一抗相結(jié)合,一抗與細(xì)胞表面抗原結(jié)合,因此使磁珠與細(xì)胞相連,從而在磁場作用下,對細(xì)胞進(jìn)行分離。直接法分離得到的連有磁珠的細(xì)胞可直接用于功能實(shí)驗(yàn)或流式細(xì)胞儀檢測。間接法分離得到的連有磁珠的細(xì)胞須再培養(yǎng)2天,待磁珠從細(xì)胞上脫落下來,才能進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)或流式細(xì)胞儀檢測。近年來,開發(fā)了生物素標(biāo)記的單抗--親和素/鏈霉親和素—生物素結(jié)合的磁珠實(shí)驗(yàn)體系(BAB法)。利用生物素和親和素之間的高親和力及生物放大效應(yīng)來增強(qiáng)IMB與細(xì)胞的特異性結(jié)合,從而提高細(xì)胞分離效率。為了分離后迅速進(jìn)行分離效果分析,目前有研究者將熒光素(如FITC)標(biāo)記在親和素/鏈霉親和素表面,使所分離的細(xì)胞在流式細(xì)胞儀上馬上得到檢測,從而省去了免疫熒光染色的時(shí)間。
2.根據(jù)磁珠結(jié)合的細(xì)胞與所要獲得的細(xì)胞的關(guān)系,免疫磁珠法分離細(xì)胞可分為正選法和負(fù)選法。正選法即磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞,負(fù)選法即磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞,游離于上清液的細(xì)胞為所需細(xì)胞。還有一種基于負(fù)選法的高效分離方法,即在實(shí)驗(yàn)體系中加入連接有磁珠的多種單抗,通過磁性分離器后,則所有不需要的細(xì)胞被吸附在磁架上,未被吸附的細(xì)胞為目的細(xì)胞。這種方法可一次去除多種細(xì)胞,又稱雞尾酒法(cocktail)。
免疫磁珠法分離細(xì)胞是一種90年代初興起的新型細(xì)胞分離技術(shù),所獲細(xì)胞純度高(93%-99%),獲率可達(dá)90%,活細(xì)胞率大于95%,且操作簡單,不需使用離心沉淀分離技術(shù),省時(shí)且費(fèi)用低。